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  • Waters
    LC 시스템
  • Q :  시료 주입량을 증가시켰더니 피크에 테일링 (tailing)이 생기고 브로드해지기 시작했습니다. 시료의 농도가 매우 낮아서, 이 정도로는 컬럼이 오버로드 (overload) 되지는 않을 것으로 생각했는데요, 이러한 현상이 일어나는 원인에 대해 좀 더 알고 싶습니다.

     

    A : 컬럼 오버로드 (overload)는 주입량이 증가함에 따라 피크모양이 일그러지는 여러 원인들 중 하나에 불과합니다. 이동상이 오버로드 된 경우, 그리고 시료가 이동상에 녹지 않을 때에도 그러한 현상이 일어날 수 있습니다.

     

    우선 컬럼의 오버로드에 대해 알아보겠습니다.

    컬럼의 오버로드는 쉽게 진단이 됩니다. 일반적인 분석물질의 경우, 오버로드는 컬럼부피 (column volume) mL당 시료 0.1 mg~ 1 mg을 주입하면 시작됩니다. 만일 UV 검출기를 사용한다면, 다른 기준을 사용할 수 있습니다. 강한 UV 흡광성분 (UV chromophore)을 가진 대부분의 분석물질은 피크높이가 0.1 AUFS에 이르면 오버로드 (mass overload)가 시작됩니다.

     

    다른 원인은 시료를 녹이는 용매에 있습니다. 시료를 이동상 보다 더 강한 용매에 녹이면, 피크가 일그러지게 됩니다. 여기에는 여러 이유가 있을 수 있습니다.

    고체상추출법 (SPE)을 통해 시료를 처리한 경우, 이동상보다 강한 용매로 시료를 용출(elution) 시켰을 때 그럴 수 있습니다. 이럴 때에는 더 약한 용매로 시료를 희석시키기만 해도 이러한 문제를 피할 수 있습니다. 아니면, 시료의 용매를 모두 날리고 이동상 또는 그보다 약한 용매로 치환하면 됩니다.
     
    (다음 호에 계속)

  • Waters
    LC 시스템
  • :  HPLC 분석 감도를 높이고 싶습니다. 어떤 조치를 해야 하는지 조언을 해주세요

     

    A :  처음 시도할 수 있는 건, 검출기 노이즈 (noise)를 줄이는 것입니다. 램프에서 나오는 빛의 세기에 이상 없는지, 검출기의 셀 윈도우 (cell window)가 깨끗한지 우선 확인하세요.

     

    그게 확인되면, 검출기 반응 (response)과 검출기 노이즈 (noise)를 파장의 함수로 조사해야 합니다. 그리고 나서 최상의 signal-to-noise를 보이는 파장을 선택하세요. 이는 검출기, 이동상, 분석하고자 하는 시료마다 다릅니다. 좀더 자세히 살펴보죠.

     

    원리상, variable 파장의 검출기 노이즈는 광다이오드 (photodiode)가 받아들이는 빛의 양에 반비례합니다. 광원이 오래되었거나 window가 더러울 때 검출기 노이즈가 증가하는 이유가 바로 이 때문입니다. 이는 또한 이동상의 흡광도가 높을수록 노이즈가 증가하는 이유이기도 합니다. 예를 들어, 알코올은 210 nm에서 흡광도가 좋습니다만, 아세토니트릴의 흡광도는 매우 낮습니다. 낮은 UV에서 아세토니트릴을 사용하면 노이즈가 줄고 감도가 높은 이유가 바로 이 때문입니다. 250 nm 부근에서는 아세토니트릴이나 메탄올이 거의 비슷합니다.

     

    만일 시료에 대한 response가 좋은 파장에서 백그라운드를 갖는 이동상을 사용해야 한다면, 노이즈와 response를 파장의 함수로 측정해야 합니다. 이 값으로부터, 최고의 signal-to-noise 비를 얻을 수 있는 최적의 파장 값을 계산해야 합니다. PDA (photodiode array) 검출기를 사용하면 이 과정을 빠르게 할 수 있습니다. Peak maximum에서의 스펙트럼을 얻어 이동상의 백그라운드 스펙트럼을 비교하면 됩니다.

    그리고 나서, 최고의 signal-to-noise를 주는 파장을 선택하십시오. 그러면 주어진 이동상 조성에서의 최적의 파장을 선택한 겁니다.
     
    그 다음으로 간단한 작업은 검출기의 시간상수(time constant)를 증가시키는 것을 검토하는 것입니다.

    시간상수를 높이면 피크가 브로드 (broad)해 지고 노이즈는 감소할 것입니다. 크로마토그램에서 피크 수가 적을 경우에는 이 방법으로 signal-to-noise 비를 상당히 개선시킬 수 있습니다만, 크로마토그램에 피크 수가 많고, 그 중 일부 피크간의 분리능이 낮다면, 이러한 접근은 적용하기 어렵습니다.

     

    그 다음으로 비교적 간단히 생각해볼 수 있는 것은 주입하는 시료의 양입니다.

    우선 시료를 어떤 용매에 녹였는지 생각해보세요.

     

    이동상보다 훨씬 낮은 용해강도를 지닌 용매에 시료를 녹이면, 비교적 꽤 많은 양의 시료를 주입하여도 피크모양이 찌그러지지 않습니다. 하지만, 시료를 유기용매에 녹이고, 역상크로마토그래피에서 분리한다면 (, 이동상은 물과 MeOH 혹은 ACN의 혼합물), 적은 양을 주입해도 피크의 모양이 찌그러질 것입니다. 따라서, 이동상보다 물 함량이 20% 더 높은 용매에 시료를 녹이면, 피크의 찌그러짐(distortion) 없이 1 mL의 시료를 주입할 수 있습니다.
     
    그 다음으로 시도해 볼 수 있는 방법은 컬럼부피 (column volume)를 줄이는 겁니다. 컬럼 부피를 줄이는 가장 간단한 방법은 컬럼 길이와 입자크기는 그대로 두고, 컬럼 내경만 줄이는 것입니다. 예를 들어, 컬럼 내경을 4.6 mm 에서 2.0 mm로 줄이면 질량감도 (mass sensitivity)는 약 5배 정도 증가합니다. 게다가, 유속도 줄어들고 용매소비량도 약 5배 줄어들지요.

    반면, 장비의 확산 (bandspreading) 효과는 더 심해집니다. 장비의 확산은 크로마토그램의 분리능을 감소시키는 경향이 있는데요, 이에 대해 좀더 알아보겠습니다.

     

    장비의 확산에는 두 가지 요인이 있습니다.

    하나는 컬럼전 확산 (pre-column bandspreading) 입니다. 주입량과 주입기 (injector) 에서부터 컬럼 이전까지의 튜빙에서 확산이 일어나서 발생합니다. 이때에는 (이전 호에서 살펴본 대로) 시료를 이동상보다 용출강도가 낮은 용매에 시료를 녹이거나 시료를 용매로 희석하고 더 많은 양을 주입하여 그 영향을 줄일 수 있습니다.

     

    다른 하나는 컬럼 이후에 생기는 확산 (post-column bandspreading)으로 컬럼부터 검출기까지의 튜빙과 검출기 셀에 의해 생깁니다. 따라서, 컬럼부터 검출기까지의 튜빙 길이를 최소로 유지해야 합니다.

    검출기 셀 부피의 문제는 좀 더 복잡합니다. 밴드확산을 줄이기 위해서는 부피를 최소화해야 합니다만, 반면, 검출기 셀부피가 줄어들면 검출기 노이즈가 증가하게 됩니다. 그래서, 셀부피와 검출기 부피를 줄이기 위해 많은 노력을 했음에도 불구하고 감도 향상은 미미할 수 있습니다.

     

    Signal-to-noise비를 향상시키기 위한 또 다른 방법은 검출기를 바꿔보는 것입니다.

    일반적으로 사용하는 UV 검출기보다 형광검출기(Fluorescence detector)나 전기화학검출기(Electrochemical detector)를 사용하면 감도가 더 좋아질 수 있습니다. 물론 새로운 검출기를 구매하려면 상당한 비용이 들기는 하지만요.

    이 두 검출기들은 데이터의 signal-to-noise 비를 눈에 띄게 향상 시켜줍니다.

     

    종종 노이즈는 이동상의 성분 때문에 나타납니다. 낮은 UV 파장에서 아세토니트릴의 흡광은 메탄올에 비해 작다고 이전 호에서 언급했던 것을 기억하실 겁니다. 이렇듯 이동상을 바꾸면 분석법도 다시 개발해야 합니다.

    검출기 노이즈를 발생시키는 또 다른 주요 원인 중 하나는 이동상 내의 첨가제입니다. 피크의 꼬리끌림현상 (tailing)을 억제하기 위해 사용하는 아민(amine) 같은 것이 한 예가 될텐테요, 더 좋은 컬럼, tailing을 줄이기 위한 기술을 적용한 컬럼을 사용하면 이동상 첨가제를 쓰지 않아도 됩니다. , 피크의 꼬리끌림현상 때문에 감도가 낮아졌다면, 더 좋은 컬럼을 사용하여 꼬리끌림현상을 감소시키면 감도를 높일 수 있다는 의미가 됩니다.

     

    하지만, 이렇게 중간에 컬럼을 바꾸거나 이동상을 바꾸는 것은 부가적인 작업이 상당히 증가합니다만, 상대적으로 감도가 개선되는 폭은 작을 것입니다. 따라서, 이러한 선택은 새로운 분석법 개발을 시작하는 단계에서 신중히 고려되어야 할 것입니다.

     

  • Waters
    컬럼
  • :  당분석 전용 아민컬럼을 사용하고 있습니다. 평소 실험할 때는 모든 당 성분이 단일 피크로 나왔는데요, 최근 더블피크 (double peaks) 현상이 일어났습니다. 어떻게 해야할까요?

     

    :  일반적으로 아민컬럼은 보통 모든 당 성분이 단일 피크로 나타납니다.  더블피크 현상의 간단한 이유 중 하나는 컬럼에 충진되어 있는 입자 pore 내의 pH 때문입니다.
     
    한 아노머 (anomer)가 다른 아노머 형태로 바뀌는 속도는 pH에 영향을 받습니다. 염기성 pH에서는 굉장히 빠른 속도로 전환되므로, 하나의 단일성분이 상당이 뾰족한 피크로 나타납니다. 반면, 산성 pH에서의 전환속도는 상당히 느리기 때문에, 모든 당 성분이 뚜렷한 두 개의 다른 피크로 나타나는 것입니다. 바로 이러한 이유 때문에 당 분석을 위해 아민 컬럼을 사용하는 것입니다. 아미노기 (amino group)pore 안을 염기성 조건으로 만들기 때문에, 상호 전환이 빠르게 일어나 모든 당 성분마다 하나의 단일피크로 얻어집니다.
     
    만약 어떠한 이유에서든지 충진된 입자 pore 안의 pH가 중성 혹은 산성이라면, 모든 당 성분은 폭이 넓은 (broard) 피크나 더블피크 즉, 뚜렷이 구분되고 분리가 잘된 두 개의 피크로 나올 것입니다.
     
    앞에서 우리는 더블 피크 문제의 가장 큰 원인이 컬럼 충전입자 pore 내의 산성 pH 때문임을 알았습니다. 그렇다면 왜 pH Shift가 발생하는 걸까요?
     
    보통 이러한 작용은 정지상 즉, 충전된 입자가 노화되었을 때 발생합니다. 컬럼을 오래 사용하다 보면, 염기성 결합이 느슨해지고, 산성 실라놀기 (silanol group)가 형성되기 때문이죠.
     
    그러나, 이전 호에서 언급하였듯이, 현재 사용하는 새 컬럼에도 같은 현상이 나타나고 있기 때문에, 지금의 문제는 아마도 이동상 pH shift가 일어났기 때문이라고 말할 수 있습니다. 사용하고 계신 이동상에는 아세토니트릴, 물의 단지 두 가지 성분이 포함되어 있기 때문에, 먼저 물의 pH를 확인 한 뒤 물/아세토니트릴 혼합액의 pH를 확인하면 간단합니다.
     
    그 다음 단계는 컬럼을 재생 (regeneration)”하는 것입니다. 대부분의 컬럼이 이동상 내의 산성 성분에 의해 중화되는 것과 마찬가지로, 이러한 산성 성분들을 염기성 pH 조건으로 세척하면 제거될 수 있습니다. Tetra-ethylene pentamine과 같은 ethylenediamin oligomer의 희석액으로 세척하는 것이 가장 좋습니다. 이러한 세척법으로 컬럼을 재생할 수는 있으나, 가장 좋은 방법은 애초부터 산성 오염원을 피하는 것임을 잊지 마십시오.

  • Waters
    컬럼
  • Q :  당분석 전용 아민컬럼을 사용하고 있습니다. 이동상은 75% 아세토니트릴과 25% 물 혼합입니다. 최근 모든 성분에 더블피크 (double peaks)가 나타났는데요, 처음에는 컬럼의 수명이 다해서 그런가 생각했는데, 새 컬럼을 사용해도 마찬가지 결과입니다. 무엇이 문제일까요?

     

    A : 당분석의 이론은 다른 분리 이론보다 더 복잡합니다. 따라서, 문제의 원인이 어디에 있는지 정확히 파악해야 하겠죠. 컬럼이 수명을 다했는지, 아니면 다른 요인이 있는지를 빠르게 확인하는 쉬운 방법이 있습니다. 테스트화합물로 글리세롤 (glycerol)을 이용해 보십시오. 분석하고자 하는 어떤 당보다 머무름이 작은 성분입니다. 만일 다른 탄수화물 성분들처럼 동일한 더블피크가 글리세롤에서도 나타난다면 그 컬럼은 수명이 다한 것입니다.

     

    하지만, 다른 탄수화물 성분들은 더블피크를 나타내지만 글리세롤에서 정상적인 뾰족한(sharp) 단일피크가 나타난다면 컬럼은 문제가 없는 것입니다. 문제는 컬럼이 아닌 다른 것, 즉 이동상에 있습니다.

     

    당은 두 가지의 아노머 (anomer, 입체이성질체) 형태로 존재하는데, 용액상태에서는 이 두 가지 아노머가 평형상태 (equilibrium)로 있습니다. 이들 아노머는 HPLC로 쉽게 분리할 수 있는 분자입니다. 그래서, 하나의 당 성분에 피크가 두 개 나타나는 것이지요.

  • Waters
    컬럼
  • Q :  최근 새로운 QC 분석법이 내려왔습니다. 동일한 새 컬럼을 구입하여 그 분석법을 검증 (verification)하고 있는데, 불행히도 우리 실험실에서 분석한 머무름시간이 분석법을 만든 동료가 리포트한 머무름 시간과 꽤 다릅니다. 이러한 이유가 컬럼의 배치(batch)간 차이 때문이라면, 제가 어떻게 해야 할까요?

     

    A : 쉽지 않은 상황으로 보입니다. 배치(batch)에 따라 머무름시간 차이가 꽤 있다면, 얼마나 오랜 기간동안 이 물질을 분석해야 하는지 예측해 보아야 합니다. 프로젝트 기간이 길지 않아 적은 수량의 컬럼만 필요한 경우라면, 컬럼제조사에게 프로젝트에 사용될 배치의 충진물을 충분히 보유하고 있는지, 그리고 이 충진물로 충진된 컬럼으로 주문할 수 있는지 확인하는 것이 필요합니다. 물론, 이런 경우, 그 충진물 만큼에 해당하는 비용을 미리 지불하게 될 수도 있습니다.

     

    애초 분석법을 개발할 때 선택된 충진물로는 재현성 있는 결과를 제공하지 못한다는 것을 확인했다면, 이는 다른 충진물로 분석법 (method)을 다시 개발할 필요가 있음을 뜻합니다. 물론 시간은 많이 걸리겠지만, 충분히 가치 있는 일일 것입니다.

     

    충진물마다 재현성은 크게 다를 수 있습니다. 컬럼제조사와 이 문제에 대해 의논하고 다른 충진물을 사용했을 때 재현성이 많이 개선될 수 있는지 확인해야 합니다.

    그렇지 않다면, 재현성이 좋은 다른 제조업체의 컬럼을 고려해보아야 합니다. 물론, 이런 모든 경우 분석법 개발은 처음부터 다시 시작해야 합니다.
     
    분석법을 새로 개발할 때에는, 컬럼 제조사에서 서로 다른 배치의 충진물을 제공할 수 있는지, 그래서 새로 개발한 분석법이 배치에 따라 큰 차이가 없이 견고한지를 확신할 수 있는지 알아보아야 합니다.

    일부 제조사의 경우 배치별 차이를 미리 확인하기 위한 컬럼 세트를 제공하기도 합니다. 이 세트는 서로 다른 배치의 컬럼으로 구성되어 있는데, 이 중 적어도 하나의 컬럼은 분석법을 개발하는데 사용된 것과 같은 배치의 컬럼이어야 합니다.

    이러한 컬럼세트를 이용하면 분석법의 배치간 재현성 뿐만아니라 컬럼간의 재현성도 확인할 수 있습니다.

    오랜 기간 동안 재현성을 유지해야 하는 분석법을 새로 개발하는 분께 이러한 방법을 추천해드립니다.

     

    앞에서 제안한 모든 내용은 C18, C8과 같이 일반적인 컬럼을 사용할 경우라고 가정하여 말씀드린 것입니다.

     

    분석법이 Cyano나 아미노(amino)컬럼으로 개발되었다면, 재현성의 문제는 대부분 고정상의 안정성 한계 때문에 생긴 문제일 확률이 큽니다. 이러한 경우라면 C18, C8컬럼을 이용하여 분석법을 다시 개발하는 것을 검토해주시기 바랍니다. 물론 분석법을 다시 개발하는 것은 상당히 많은 시간이 필요한 업무입니다만, 이 경우 가장 좋은 해결법이라고 할 수 있습니다.

  • Waters
    컬럼
  • Q : 최근 새로운 QC 분석법이 내려왔습니다. 동일한 새 컬럼을 구입하여 그 분석법을 검증 (verification)하고 있는데, 불행히도 우리 실험실에서 분석한 머무름시간이 분석법을 만든 동료가 리포트한 머무름 시간과 꽤 다릅니다. 그가 사용했던 컬럼을 가져다 우리 실험실에서 분석해보니, 그와 같은 머무름을 얻었구요. 동료가 사용하던 컬럼이 1년 이상 되었는데, 혹시 컬럼 배치간 차이 때문이 아닌가 의심이 됩니다. QC부서에서 어떻게 이 상황을 처리해야 할까요? 새 컬럼을 살 때마다 분석법을 매번 다시 최적화할 수는 없질 않습니까?

     

    A : , 그렇게 해서는 안되지요. 가장 먼저 해야 할 일은 이 문제가 컬럼 배치간 차이 때문인지를 확인하는 일입니다.

     

    동료가 분석법을 만들 때 다양한 이동상에서 시도해보았을 것이라고 생각합니다. 그래서 분석법 개발하는 동안 그 컬럼이 노화되었을 것이며, 아마 일부 결합상이 떨어져나가거나, 이동상 첨가제(additive)를 강하게 흡착한 채로 분석법 개발에 사용되었을 것입니다. 이러한 현상은 비가역적으로 일어나므로, 새로운 분석법을 같은 배치의 새 컬럼으로 체크해서 동일한 결과를 얻을 수 있는지를 확인해 보는 것이 좋습니다.

     

    우선 컬럼제조사에 연락해서 이전 배치의 충전제로 새로운 컬럼을 충전해주기를 부탁해보십시오. 대부분의 제조사들은 이러한 목적을 위해 각 배치의 충전물질을 소량 가지고 있습니다. 이 것이 배치간 차이 때문에 발생한 것이 아님을 확인하는 가장 간단한 방법입니다.

    이전 배치의 입자로 충전한 새 컬럼으로 동료의 이동상조건 하에서 분석을 해보십시오. 이때, 동료가 분석한 자료와 유사한 결과값을 얻을 수 있다면, 배치간 차이로 볼 수 있습니다. 그렇지 않고 당신의 컬럼과 동일한 또는 유사한 결과를 얻으면, 동료의 컬럼이 분석법 개발을 하는 동안 노화되어서 생긴 현상인 것입니다.

  • Waters
    컬럼
  • Q : 가드컬럼이 분석컬럼을 보호한다는 점은 잘 알겠습니다만, 가격이 좀 비싸서 망설여지네요. 컬럼을 세척하는 과정에 대해 알고 싶습니다.

     

    A : 컬럼의 세척 (clean-up)은 다른 방법이 없을 때 가장 나중에 사용할 수 있는 수단으로 봅니다.
    컬럼 세척에 있어서 고려해야 할 점은, 컬럼 내의 오염물질이 무엇인지 알고 있을 때에만 가장 효과적으로 세척할 수 있다는 사실입니다. 그러나, 대부분의 경우는 오염물질에 대해 전혀 알지 못하고 단지 어떤 종류의 오염물질이 있을지 추측만 할 수 있을 뿐이며, 일부 오염물질은 제거하기 어려운 경우도 있습니다. 혈장 (plasma)과 같은 시료의 경우, 오염물질 대부분이 적은 양의 단백질로 이루어졌을 것이라 생각할 수 있는데, 이에 대한 효과적인 세척 프로토콜을 찾기는 쉽지 않습니다. 컬럼 제조사들이 일반적으로 사용할 수 있는 세척방법을 제공하기도 하는데, 이 방법은 꽤 복잡하며 도움이 될 수도, 되지 않을 수도 있습니다. 또한, 이러한 모든 세척과정에는, 오염물질을 제거할 수 있는 계열의 용매를 잘 선택해야 합니다. 이 용매를 찾아내기에 상당한 시간이 필요할 것이며, 세척을 한다해도 이 또한 성공 여부를 장담할 수 없습니다.

     

    이러한 이유로, 저는 가드컬럼의 사용을 선호합니다. 가드컬럼은 컬럼을 망가뜨릴지도 모르는 오염물질을 잡아내기 때문입니다. 가드컬럼의 가격은 보호하고자 하는 분석용(analytical) 컬럼 가격의 일부일 뿐이므로, 가드컬럼이 비싸다고 볼 수만은 없습니다. 완벽한 컬럼 세척 과정을 포함하여 컬럼 재평형화를 완료하는 데에 몇시간이 걸리는 것에 비해 가드컬럼을 교체하는 데에는 아주 잠깐의 시간이 걸릴 뿐입니다. 시간을 절약하고 컬럼의 악화를 줄여주는 아주 중요한 역할을 합니다. 앞서 언급했던 원칙을 지킨다면, 가드컬럼은 확실한 분석을 보장하고 많은 골칫거리로부터 우리를 보호해 줄 수 있을 것입니다.
  • Waters
    컬럼
  • Q :  가드컬럼을 사용한 적이 있었는데, 결과는 별로 좋지 않았습니다. 피크가 처음부터 오른쪽으로 찌그러져 나왔어요. 그래서인지, 가드컬럼을 사용하는 게 분리능에는 좋지 않은 것 같다는 생각이 듭니다.

     

    A :  가드컬럼의 선택에 문제가 있었던 것 같습니다.
     
    가드컬럼은 분석컬럼의 충전제와 동일한 입자로 충전된 것을 사용하도록 권장합니다. 그럴 경우, 가드컬럼은 분석컬럼을 연장한 것 같은 작용을 할 것이며, 주컬럼에서 일반적으로 흡착하게 될 오염물질을 잡아주게 될 것입니다.
     
    가드컬럼이 잘 충전되어 있다면, 분리성능에 손상을 주는 정도를 최소화할 수 있습니다. 일부 경우에는 전체 성능에 약간의 향상을 가져다 줄 수도 있습니다. 그러나, 가드컬럼에 있어 가장 중요한 기능은 분석컬럼을 보호한다는 점입니다.
     
    분석컬럼에 사용한 것과 다른 충전제의 가드컬럼을 사용할 경우에는 피크 모양이 찌그러질 수  있습니다. 또한, 가드컬럼이 분석컬럼을 얼마나 잘 보호할 수 있을지 예측할 수 없습니다. 이는 서로 다른 충전제의 머무름 특성이 다르기 때문에 그렇습니다.
     
    그러므로, 가드컬럼의 충전물질과 분석컬럼의 충전물질을 동일하게 맞추는 것이 항상 중요합니다. 컬럼을 최상으로 보호해주고, 피크모양이 찌그러지는 것은 최소화 할 수 있습니다.
  • Waters
    컬럼
  • Q :  지금 사용하고 있는 컬럼의 수명이 그리 길지 않습니다. 500번 정도 주입했을 뿐인데, 피크가 브로드해지고 꼬리끌림 (tailing)이 시작되었어요. 이전에 사용하던 컬럼은 거의 1,000회 가량 주입할 때까지 괜찮았던 것 같은데, 이 컬럼에 무슨 문제가 있는 것인가요?

     

    A :  컬럼 자체의 문제가 아닐 가능성이 큽니다. 가드컬럼을 사용하고 계신가요? 가드컬럼을 사용하지 않고 precolumn 필터만 사용하고 있다면, 안타깝게도, precolumn 필터는 이동상과 함께 이동하는 작은 입자를 제거할 목적으로 사용하는 것이므로 컬럼을 일부만 보호해줄 수 있습니다. , precolumn 필터는 충진물 표면에 흡착되는 물질이나 필터를 통과하는 작은 물질로부터는 컬럼을 보호할 수 없지요. 이런 작은 물질은 샘플로부터 오는 경우가 대부분이므로 샘플이 무엇인지가 이런 문제를 확인하는데 중요합니다.

     

    Q. : 시료는 고체상추출법(Solid-phase extraction,SPE)으로 추출한 플라즈마 입니다. 인정하건대, 플라즈마 성분은 컬럼의 수명을 꽤 빠르게 단축시킵니다. 그러나 크로마토그램은 많지 않은 바탕간섭과 함께 상당히 깨끗합니다. 더욱 중요한 것은 이전에는 1000회 이상의 주입도 컬럼이 망가지지 않았으며, 오직 지금 사용 시에 더욱 빠르게 악화되는 것을 확인하였습니다.

     

    A. : 많은 경우, 시료전처리 과정은 완벽하고 깨끗하지 않아, 일부 불순물이 남아있게 되고, 크로마토그램에 바탕간섭으로 여전히 나타나게 됩니다. 또는 시료 중의 단백질이 컬럼 내의 충전물질과 강하게 흡착하여, 천천히 컬럼 끝에 축적되어 바탕간섭으로 나타날 수 있습니다. 게다가, 이러한 바탕간섭을 일으키는 물질의 농도는 시료에 따라 다릅니다. , 시료전처리 이후에도 불순물이 남아 있거나, 단백질이 충전물질과 흡착하면서, 컬럼의 수명이 줄어드는 것은 별로 놀랄만한 일이 아니지요. 그러므로 이러한 오염으로부터 컬럼을 보호하기 위해서는 가드컬럼을 꼭 사용하도록 권해드립니다.

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    LC 시스템
  • Q :  펌프 두개로 작동하는 그레디언트 시스템에서 사용하던 등용매 분석법 (isocratic method)을 최근 펌프 하나로 작동하는 시스템에서 사용하게 되었습니다. 그런데, 이 두 시스템에서의 머무름시간 (retention time)의 차이가 꽤 나더라구요. 메탄올과 물이 각각 50% 이었습니다. 이유는 무엇일까요?

     

    A :  가장 큰 이유는 mixing 하면서 용매의 수축 (또는 팽창)이 일어났기 때문입니다. 역상의 이동상을 준비하는데 있어 오래 전부터 있었던 이슈입니다.

     

    물이나 버퍼에 메탄올, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란을 섞을 때 일반적으로 부피가 줄어듭니다.
    특히, 메탄올과 물의 혼합물은 HPLC에서 용매 부피가 가장 많이 줄어드는 경우입니다.

     

    용매를 어떻게 섞었느냐에 따라 머무름에 많은 차이가 생깁니다. 메탄올 500 mL와 물 500 mL를 각각 준비하여 섞는 경우와, 메탄올 500 mL에 물에 부어 1 L를 맞추는 경우는 같은 조성을 얻을 수 없습니다. 조성이 같지 않으면 두 혼합용액의 용출강도 (elution strength)가 같을 수 없으며, 용출강도가 다르면 머무름 시간도 달라집니다.
     
    Mixing의 영향이 분리에 어떤 영향을 주는지 확인해보겠습니다. 시료는 아세톤에 녹인 폭약성분입니다. 이동상으로 40% 물과 60% 메탄올을 사용하여 4.6 x 250 mm C18 컬럼으로 분리하였으며, 이동상은 4가지 다른 방법으로 준비하였습니다.

     

    첫 번째 경우는 400 mL의 물을 1 L 플라스크에 부은 뒤 그 플라스크에 메탄올을 부어 1 L를 채웁니다. 이 때 두 가지 용매가 섞여 혼합물이 되는 동안 수축이 일어나기 때문에 메탄올은 600 mL 보다 더 많은 양이 들어가게 되며, 그로 인해, 이동상의 용출강도는 커지고, 머무름 시간은 다른 방법으로 조제했을 때 보다 짧습니다.

     

    두 번째 경우로는 메탄올 400 mL와 물 600 mL를 각각 계량하여 플라스크에서 혼합합니다. 머무름 시간은 앞의 경우보다 길어집니다. 나중에 더 자세히 이야기하겠지만, 이렇게 조제하는 것이 가장 바람직한 방법이라 할 수 있으며, 실험실에서 이동상을 제조할 때에 가장 많이 사용되는 방법이기도 합니다.

     

    세 번째 경우, 두 개의 펌프로 구성된 그레디언트 시스템에서 메탄올과 물의 양을 정확히 맞춰 이동시킵니다. 두 용매의 혼합은 고압에서 이루어 집니다. 이 경우의 이동상 조성은 두 번째 경우의 이동상조성과 동일합니다. 그러나 혼합된 용매의 수축이 펌프 뒤에서 일어나기 때문에 결론적으로 실제 유속은 1mL/min보다 작습니다. 그러므로 용매가 정밀하게 섞이는 동안에 더 느린 유속으로 인해 머무름 시간은 길어집니다.

     

    네 번째 경우는 첫 번째 방법과 반대입니다. 메탄올 600 mL을 메스플라스크에 넣은 후 물로 1 L를 채웁니다. 혼합물의 수축으로 인해 400 mL보다 더 많은 양의 물로 플라스크를 채우게 됩니다. 그 결과 이 이동상은 물의 함량이 더 커졌기 때문에 다른 경우보다 머무름 시간이 더 길게 됩니다.

     

    두 번째 경우가 이동상을 제조하는 가장 이상적인 방법입니다. 이 방법은 일반적인 낮은 압력의 그레디언트 혼합 시스템 (low-pressure gradient mixing system)과 가장 유사합니다. 또한, 혼합한 후에 부피를 측정할 필요가 없기 때문에, 용매를 혼합할 때 생기는 가열이나 냉각으로부터 발생하는 문제들을 방지할 수 있습니다.
     

     

    서로 다른 방법으로 제조된 이동상을 사용한 폭약의 분리

    Sample: 아세톤에 녹인 폭약(octogen, hexogen, tetryl, trinitrotoluene, nitropenta)
    Column: Grom-Sil 80 DOS-7 PH (4.6 x250 mm, 4um)
    Detector: UV at 220nm
    Mobile phase: 40% water, 60% MeOH
    Flow rate: 1mL/min

     

    두 시스템에서 머무름 시간이 다르게 나타난 것은, two-pump 시스템과 single-pump 시스템이 이동상을 준비하는 방식이 다르기 때문입니다. 지난 호에서 언급한 이동상 준비방법 중 두 번째, 세 번째 경우에 해당되는 거죠. (그림참조)

     
    이 두 경우, 이동상 조성은 서로 같고, HPLC 시스템에서의 실제 유속만 약간 다를 뿐입니다. 그러므로, 머무름 인자와 분리의 선택성은 완전히 같습니다. 이러한 관점에서 볼 때, 한 시스템에서 다른 시스템으로 분석법 이전은 성공적으로 수행되었다 할 수 있겠습니다. 두 시스템에서 실제 유속이 약간 달라 머무름 시간에 차이가 있는 것은 염려할 것도 아닙니다.

    Two-pump 시스템에서 single-pump 시스템으로 분석법은 성공적으로 이전된 것 입니다.

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