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제조사 Waters
제품명 HPLC 컬럼
제목 [Cosmetic] Waters UPLC/PDA/Mass를 이용한 화장품 미백성분 분석
내용


UPLC/PDA/Mass를 이용한 화장품 미백성분 분석

 

Introduction


Nicotinamide(니코틴아미드), Arbutin(아르부틴), Salicaylic acid(살리실산)은 균일한 피부톤을 만드는 목적으로 화장품 미백제에 흔히 사용된다. 피부에 멜라닌 색소가 침착하는 것을 방지하고 기미나 주근깨 등의 생성을 억제함으로써 피부 미백에 도움을 주는 기능을 가진다.


 Tretinoin(트레티노인)은 광노화(미세주름, 기미, 주근깨와 같은 색소침착), 주름 예방 및 이미 발생한 미세주름이나 여드름에 효과적으로 작용한다. 하지만 과다한 각질탈락, 일시적 여드름(피지 과다 분비), 접촉성 피부염이라는 부작용을 가지고 있다. 


 Corticosteroids(코리코스테로이드: 부산피질 스테로이드)또한 장기적인 다량 투여시에 당뇨병, 정신 이상 증세, 감염, 소화성 궤양, AVN(무혈관성 골괴저), 백내장, 녹내장, 골다공증, 쿠싱병 등이 나타날 수 있다. Corticosteroids나 Tretinoin과 같은 활성원료의 사용은 부작용 발생의 가능성이 있기 때문에 화장품 원료로서의 사용을 금지하고 있다.


Hydroquinone(하이드로퀴논)도 강력한 멜라닌 생성 억제제로, 피부미백에 관련된 제품에 주로 사용이 되는 성분이지만 가장 독성이 강한 성분 중 하나이다. 그 결과, EU에서는 화장품 원료로서의 사용을 금지하였고, 미국은 2%를 초과하면 사용할 수 없음을 규정하고 있다.

 

 이번 연구에서는 온라인 판매업체에서 구매한 화장품(크림, 겔)에서 UPLC/PDA/Mass를 사용하여 Als(활성원료)들을 추출 및 분석하였다. 


 Waters CORTECS 2.7㎛ Column은 극성과 비극성 물질 모두에 특출한 머무름을 가지고 있어

효과적인 분석이 가능하다. CORTECS T3 컬럼은 최적화된 pore size와 C18 리간드 밀도, 컬럼 말단처리(End cap) 기술을 가졌다. 또한 100% 수용성 이동상 사용이 가능하며, 극성과 비극성 물질분석에 최적화 되어있다.


 몇몇의 샘플에서는 사용이 금지된 피부 미백물질에 대해 양성반응을 보였다.


화장품에서 라벨 표기는 오해의 소지가 있을 수 있다. 동봉된 제품 정보에 AI(활성원료)가 기록되어 있지 않아, 잘못된 장기간 사용 및 부작용이 발생할 가능성이 높아진 사례가 있다.

 

 

 



Method


Figure 1. 연구에 사용된 미백성분의 실험식과 분자식



분석장비 및 소프트웨어

Waters ACQUITY Arc System / 2998 PDA / QDa Mass Detector / Empower 3 Software


시료전처리


① 8개 미백성분을 포함한 스탠다드 물질(Figure 1)과 4개의 파라벤¹을 메탄올에 녹인 후 준비한 용액에 순차적으로 희석한다.

② 기성 화장품에서 얻은 크림이나 겔 성분을 사용하여 Calibration Curve를 만든다.

③ 표본 1g을 15㎖ 원심분리기 튜브에 넣고 아세토니트릴 100㎕를 넣는다.

④ 혼합액을 볼텍스믹서 한 후 10분 동안 shaking 한다.

⑤ 아세토니트릴 4.9㎖를 추가하고 샘플을 다시 25분 동안 shaking 한다.

⑥ 샘플은 10분동안 3000rpm으로 원심분리기에 넣는다.

⑦ 원심분리기로 상층액을 0.2㎛ PVDF 필터로 필터링한다.

⑧ 화장품 샘플 1g을 추출단계에서 아세토니트릴 5㎖를 사용하여 동일방법으로 추출한다.

 

LC 조건

 

Column : CORTECS T3, 3.0 X 100mm 2,7㎛ (Part number : 186008489)

✽ Solvent A : 0.1% formic and in water

✽ Solvent B : Methanol

✽ Flow rate : 0.8㎖/min

✽ Column temp. : 30℃

✽ Injection Volume : 0.5~1㎕

✽ Gradient conditions

         A       B
 0 min     100%      0%
 0.5 min     100%      0%
 2.2 min      98%      2%
 6 min       5%     95%
 8 min       1%     99%
 9 min       1%     99%

 

 

Mass 조건

 

✽ MS System : ACQUITY Qda

✽ Ionization : ESI + and / or ESI -

✽ MS Scan range : 100 to 600 m/z

✽ Sampling rate : 5 Hz

 

¹파라벤: 파라하이드록시벤조산에서 파생되는 에스터 또는 염의 일종으로, 박테리아와 곰팡이를 죽이는 성질이 있어서 화장품의 보존제로 사용되어 왔다.

 



결과 및 토의


Figure 2. ACQUITY Arc UV chromatogram at 254㎚ using CORTECS T3 3.0x 100㎜ 2,7㎛ 1㎕ injection


✽ Figure 2는 Waters ACQUITY Arc PDA System을 사용하여 12개의 스탠다드 혼합물을 분석한 크로마토그램이다.

✽ Empower 소프트웨어 공정은 실험적으로 알려진 스탠다드 성분의 Retention time (tR)을 사용하여 분석물질을 확인한다.

✽ 보존료로 잘 알려진 4개의 파라벤은 화장품 샘플에서 많이 검출된다. (Figure 2, peaks 4,6,7,8)

 


Figure 3. ACQUITY Arc 254nm using CORTECS T3 3.0x 100 mm 2.7um column, 100ug/ml, 0.5ul injection

미백겔 분석 크로마토그램



 

화장품 샘플에서 Clobetasol Propionate 확인

 

✽ 염증 및 가려움을 완화하는 외용 스테로이드제로, 주로 머리부위의 건선, 습진 치료에 사용된다.

✽ Figure 3은 미국 인터넷에서 판매중인 미백 겔 샘플에서 추출한 것에 대한 크로마토그램이다.

✽ 샘플에서는 Empower 소프트웨어를 이용하여 4개의 잘 알려진 파라벤인 Arbutin,

Corticosteroid, Clobetasol, Proponate가 포함되어 있음을 확인할 수 있다.

 

 

Figure 4. Clobetasolpropionate의  PDA 와 Mass Detection 비교. . 같은 UV spectra, m/z 동위원소로 관찰


✽ Figure 4는 Clobetasol propionate의 UV와 Mass spectra를 가지고 비교한 그래프이다.

✽ Clobetasol propionated의 UV spectrum과 46m/z는 스탠다드 샘플 둘 다 동일하게 확인된다.

 

 

Figure 5. ACQUITY Arc UV chromatogram at 254㎚ MJ-1 샘플결과. 1000㎍/㎖, 1㎕ injection



Quantitation


Table 1. 샘플에서 선택된 미백성분의 수치와 일반적인 사용 레벨



✽ Calibration curves (R²>0.999)에 매치된 Matrix는 샘플분석에 양을 확인하기 위해 사용되

   었다. Table 1의 결과는 샘플에서 검출된 대부분의 구성요소가 일반적인 사용범위에 있다

   는 것을 보여준다. Sample matrix로 사용하기 위해 Clobetasol Propionate, Betamethasone

   17-valera는 0.01-1% w/w농도 범위 내에 사용했으며, Hydroquinone 0.01-5%로 분석했다.

   NS 샘플은 Calibration range 내 Hydroquinone 검출을 맞추기 위해 1:1로 희석했다.

 


 

결론


✽ CORTECS T3 컬럼은 극성과 비극성 물질 분석에 탁월한 효과가 있다.

이 컬럼을 이용하여 UHPLC 분석하였고, 피부미백성분과 파라벤을 한 번에 분석 가능했다.


✽ Empower processing method는 스탠다스 성분으로, 테스트 성분의 정성,정량이 가능하다.


✽ UV와 MS spectral matching은 샘플의 정성을 확인하기 위해 사용된다.


✽ 4개의 샘플에서 Corticosteroids가 확인되며, 그 중 2개는 Tretinoin이 검출되었다.

확인 된 양은 일반적인 사용량이거나 그보다 많다.


✽ Hydroquinone는 3개의 샘플에서 검출되었으며 3% w/w로, EU와 US 규정을 위반한다.


✽ 샘플분석의 몇몇은 Als를 라벨이나 동봉되는 성분분석표에 공지하지 않았다. 화장품은

보통 의학적 자문없이 오랜 기간 사용하기 때문에, 화장품의 정확하지 않거나 충분하지 않은 성분 표기는 부작용의 위험을 가중시킨다.


 


 

참고

 

1. Desmedt,B. Courselle, Pm De Beer, J.O.Rogiers, V. Deconinck, E. DE Paepe, K (2014)

Illegal cosmetics on the EU market: a threat for human health? Arch. Toxicol.88.1765-1766

 

2. Desmedt,B.Van Hoeck,E.Rogiers, V.Courseklle,P.De Beer,J.O.De Paepe,K.Deconinck,E.(2014) Characterisation of suspected illegal skin whiteing cosmetics.J.Pham.Biomed.Anal 90:85-91.

 

3. Fiori,J.Andrisane,V.(2014) LC-MS method for the simultaneous determination of glucocorticoids in pharmaceutical formulations and counterfeit cosmetics products. 91:185-192.

 

 



 

담당자

분석기술사업부 나정임 차장 (031-8033-0666)

 

 

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